一种毛白杨胚囊的分离方法

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成果名称: 一种毛白杨胚囊的分离方法 关键字: 应用行业: 农业
高新技术领域: 农业技术 所在地: 河北省 知识产权类型: 发明专利
知识产权编号: CN201810114732.1 成果体现形式: 发明专利 成果属性:
成果所处阶段: 成果水平: 国内一般 研究形式:
学科分类: 战略新兴产业: 请选择... 课题来源:
第一完成单位名称: 保定学院 第一完成单位属性: 技术成熟度:
合作方式: 专利许可 交易价格(万): 面议 所属十强产业:

利用酶解‑解剖法结合吸吹的方法,从新鲜毛白杨胚珠中分离得到了完整的胚囊,获得率高达8.7%;同时筛选出分离毛白杨胚珠的混合酶液成分包括半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、甘露醇、BSA,酶解处理后经过醋酸洋红染色和透明处理,在倒置显微镜下观察,看到了完整清楚的毛白杨胚囊的形态与内部结构,呈长椭圆形,大小为2.52µm左右,单珠被,5‑6层珠心细胞,珠孔端有卵器细胞存在,合点端有类似反足细胞的结构。该技术方案同样可应用于长寿花的胚囊分离中。

 本发明涉及一种植物胚囊的分离与提取的步骤,具体为毛白杨及长寿花的分离与提取。


动物和低等植物而言进行精、卵细胞的离体操作实验相对容易,原因是在其受精过程中,精细胞与卵细胞的融合是在脱离或半脱离母体的状态下完成的,因此取得的研究结果也较为深入。然而高等植物则不同,其卵细胞深藏在子房中的胚珠深处,为卵细胞的发育机理和离体操作研究带来了很大的困难。利用分离的精细胞、卵细胞在体外诱导融合、重演受精过程的离体受精技术排除了体细胞组织的干扰,使定点追踪受精过程中卵细胞由受精引起的细胞和分子变化得以实现,这也是目前研究受精机制的主要有效手段。分离植物生活卵细胞是进行植物生殖细胞工程研究的基础之一,而卵细胞位于胚囊之中,因此分离生活胚囊是分离生活卵细胞的第一步。而分离的胚囊可以观察到卵细胞进而可利用一定的方法得到卵细胞,卵细胞不仅可以用以开展离体受精研究,也可提供用分子生物学方法研究被子植物卵细胞发育和合子发育机理的实验基础。前苏联学者最早采用酶解法分离胚珠得到生活胚囊。我国学者在金鱼(Antirrhinum majus L.)、烟草(Nicotiana tabacum)中进行了分离生活胚囊的研究工作,目前已从一些植物中分离出生活胚囊及其组分。Kranz等应用分离的玉米(Zea mays L)精、卵细胞体外诱导融合并成功地再生出可育植株。14年后,第二例离体受精实验在水稻中也获得成功。之后从牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)、蓝猪耳(Torenia fournierri Linden.ex Fourn.)和黄花木曼陀罗(Datura aurea)等植物中分离出生活的胚囊或卵细胞等其他结构。
 胚囊观察是植物胚胎发育研究中的一个重要方面,经典的方法是石蜡包埋、切片观察,但是由于它制片过程繁琐,耗时长,而且这一方法将立体的结构平面化,必须做大量的连续切片观察,才能抽象出胚囊的真正原貌。这使得植物胚胎学研究不仅难度大,而且工作繁重,耗费研究人员的大量时间和精力,影响着植物胚胎学研究的广泛开展。周嫦、杨弘远和洪亚平等人提出,如果在做胚胎学研究之前,先对胚珠、胚囊等结构进行人工分离,便能建立起有关胚珠和胚囊等结构的立体观念。这样在观察切片时,就可以很容易地判读出各个切片所反映出的结构信息。同时洪亚平(2010)还提出,若将人工分离出来的胚珠、胚囊和卵细胞等微小结构在解剖镜下进行微型包埋、切片和制片,就可以极大地改善植物胚胎学的制片效果和工作效率。然后采用杨弘远提出的整体染色与透明技术,对分离出的胚珠和胚囊等结构进行整体染色与透明,还可以进一步简化植物胚胎学的研究过程。然而,分离植物胚囊和卵细胞并非易事,因为高等植物雌配子体(胚囊和卵细胞)深藏在胚珠的珠心中,而珠心又被层层体细胞包裹。前苏联学者最早采用酶解法酶离胚珠得到胚囊,我国学者在金鱼草、烟草和泡桐中进行了分离胚囊的研究工作。目前已从多种植物中分离出胚囊及其组分,充分表明植物胚囊的分离已经克服了主要的技术障碍。尽管如此,对于一种“新”的植物而言,其胚囊的分离仍然是一个挑战。
毛白杨(Populus tomentosa Carr.)是我国北方重要的乡土树种,也是木本植物研究的模式植物,在我国有很大的栽培面积,其育种学研究具有重要意义。但是,目前有关其胚囊和卵细胞的分离及后续的离体受精等研究未见报道。因此,对毛白杨胚囊和卵细胞进行分离具有一定的理论和实践意义。从毛白杨的生物学特点上看,毛白杨的胚珠小,单珠被,易于酶解;同时,在同一个子房内有很多胚珠,取材十分容易,所以是较为理想的木本植物研究材料。
 迄今为止,胚囊分离和卵细胞分离成功的植物品种并不多,尤其是双子叶植物成功的植物品种更少,为了提供更多的植物胚囊发育、生殖学的理论依据,需要增加新的植物胚囊分离的案例,关于长寿花胚囊、卵细胞等的分离未见报道。长寿花(Kalanchoe blossfeldiana Poelln.),为景天科属多年生常绿多浆植物,叶片翠绿,花朵密集,花色丰富。它既可观叶也可观花,可用于盆栽、花坛布置,有较高的观赏价值,因一年四季都开花,所以在做实验时不会受季节限制,取材方便。而且,长寿花心皮有4,有胚珠无数,倒生胚珠,单珠被,厚珠心,胚囊发育为蓼型,取材较为容易,是进行胚囊分离的理想材料。


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